蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以与游离的己糖或多糖中的己糖基、戊糖基及己糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。本法多用于测定糖原的含量，也可用于测定葡萄糖的含量。

测糖试验

　　一 实验目的 掌握蒽酮比色法测糖的原理和方法

　　二 实验原理 蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖 基及已糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。

　　三 实验器材及试剂

　　马铃薯干粉

　　可调试移液器或移液管

　　可见分光光度计(723型)

　　电子分析天平

　　水浴锅

　　电炉子

　　蒽酮试剂:取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，以80%H2SO4定容到1000ml，当日配制使用。

　　标准葡萄糖溶液(0.1mg/ml):100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中，定容到1000ml备用。

　　四、操作

　　1.制作标准曲线

　　取7支干燥洁净的试管，按表1顺序加入试剂，进行测定。

　　以吸光度值为纵坐标，各标准溶液浓度(mg/ml )为横坐标作图得标准曲线。

　　表1 蒽酮比色法定糖--标准曲线的制作

　　沸水浴中准确煮沸10min，取出用流水冷却，室温放10min,于620nm处比色

　　葡萄糖浓度(mg/ml)

　　2.样品含量的测定

　　样品液的制作:

　　精确称取马铃薯干粉0.1g置于锥形瓶中-→加入30ml沸水-→沸水浴30min(不时摇动)-→取出，

　　3000rpm离心10min(或过滤)-→反复洗涤残渣2次-→合并滤液-→冷却至室温-→定容到50ml的锥形瓶中-→再从中取出1ml，再定容到10ml的容量瓶中

　　样品液的测定:

　　(1)取4支试管，按照表2加样(加蒽酮时需要冰水浴5min冷却)

　　表2 蒽酮比色法定糖--样品的测定

　　(2)加样冷却完成后置沸水中煮沸10min，取出流水冷却放置10min，620nm处比色测量各管OD值。

　　(3)以1号试管作为调零管，2、3、4号管的OD值取平均后从标准曲线上查出样品液相应的含糖量。

　　3.结果计算:

　　C×V

　　w = ----×100%

　　m，

　　式中w:糖的质量分数(%)

　　C:从标准曲线中查出的糖质量分数(mg/ml)

　　V:样品稀释后的体积(ml)

　　m:样品的质量(ml)

　　原理

　　植物在个体发育的各个时期，代谢活动也发生相应的变化，碳水化合物的代谢也不例外，其含量也随之发生变化。了解可溶性糖含量的变化，在生理上和实践上都有重要的意义。这里介绍的是蒽酮比色法，糖在硫酸的作用下生成糖醛，糖醛再与蒽酮作用，形成一种绿色的络合物，颜色的深浅与糖含量有关。方法简便，但没有志一性，对于绝大部分的碳水化合物都能与蒽酮反应，产生颜色。

　　仪器药品

　　721型分光光度计 分析天平

　　研钵 恒温水浴锅

　　烧杯 容量瓶

　　三角烧瓶 大试管

　　移液管 漏斗

　　乙醚 草酸钠

　　饱和醋酸铅

　　葡萄糖标准溶液:称取已在80℃烘箱中烘至恒重的葡萄糖100mg，配制成500ml溶液，即得每ml含糖为200μg的标准溶液。

　　蒽酮试剂:称取1g经过纯化的蒽酮，溶解于1000ml稀硫酸中即得。硫酸溶液由760ml浓硫酸(比重1.84)稀释成1000ml而成。

　　操作步骤

　　1.可溶性糖的提取

　　称取重约5g的新鲜植物叶子，于研钵中乙醚少许，仔细研磨成均匀的浆状物，倒入烧杯中，用70℃热水洗涤研钵，洗液并入烧杯中，再加蒸镏水30─40ml。将烧杯放在水浴锅中加热，保持温度70─80℃约半小时，冷却后1滴1滴地加入饱和中性醋酸铅，以除去蛋白质，直至加入醋酸铅时不再形成白色沉淀为止。然后将此混合物连同残渣一并洗入100ml容量瓶中，加水至刻度，充分振荡。以干燥漏斗将滤液过滤于一干燥的三角烧瓶中，瓶中事先放有少量(约0.2─0.4g)草酸钠粉末，以除去滤液中过量的醋酸铅，使生成草酸铅沉淀，再行过滤，所得的透明滤液即为可溶性糖提取液。

　　2.显色及比色

　　吸取上述糖提取液1ml，放入一干洁的试管中，加蒽酮试剂5ml混合之，于沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却，然后于分光光度计上进行测定，波长为625nm，测得吸光度。从标准曲线上查得滤液中的糖含量(或经直线回归公式计算)，然后再行计算样品中含糖百分数。

　　3.绘制标准曲线

　　取标准葡萄糖溶液将其释成一系列不同浓度的溶液，浓度分别为每ml含糖0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg。按上述方法分别测得其吸光度，然后绘制A026-糖浓度曲线，或进行直线回归求得直线方程。

　　4.计算样品中含糖百分数(% )

　　设V为植物样品稀释后的体积(ml)

　　C为提取液的含糖量(μg/ml)

　　W为植物组织鲜重(g)

　　则得计算式如下: %=C×V/(W×1000000)×100%

多糖含量

　　[a]多糖含有几百个或更多残基，但只有一个还原基团，因此它的还原能力极弱，对于他们的测定，应先将它们用酸水解成单糖组分。

　　蒽酮比色法是一种快速而简便的定糖方法，糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛及其衍生物，该衍生物与蒽酮发生反应，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收。因此可用此方法测定多糖含量。

　　[b]试剂

　　2g/L蒽酮试剂:溶解2g蒽酮于1L浓硫酸(98%的浓硫酸)中，当日配制使用。

　　0.01g/L葡萄糖溶液(可加几滴甲苯作防腐剂)

　　0.1g/L糖元溶液

　　[c]实验器材

　　试管及试管架 吸量管(1ml，5ml) 恒温水浴箱(100℃) 制冰机 紫外分光光度计 滴管 白瓷板

　　制作标准曲线

　　准确称取0.1g葡萄糖(分析纯)，溶解并用蒸馏水定容至100ml后，分别取出1ml,2ml,3ml,4ml,5ml分别加入到50的容量瓶中，并用蒸馏水定容到50ml，配成浓度分别为20ug/ml,40ug/ml,60ug/ml,80ug/ml,100ug/ml,各取1ml于试管中，再加入3ml的蒽酮试剂，迅速浸入冰水中冷却，待几支试管均匀加完后，一起浸入100℃恒温水浴箱中，为防止水分蒸发，应在试管口上加盖一个玻璃球或者加一个塞子，自温度重新升至100℃起计时，准确保温10min后取出，用流动水冷却，然后，于室温中平衡片刻(约10min左右)，在分光光度计上，波长620nm处，用0.5cm厚度的比色杯，以空白管做对照空白(此处的空白是指不加葡萄糖的蒽酮试剂，其他反应条件都一致)，进行比色。

　　既得标准曲线。

　　如下表格

　　[d]样品测定

　　如上述条件一致，但要记得用除去蛋白质的样品溶液进行测定，否则会影响测定结果。

　　样品含糖量计算:

　　C×V2×D

　　样品含糖量(%)=----------------------×100%

　　W×V1×10

　　其中C----在标准曲线上查出的糖含量(ug),

　　V2---提取液总体积(ml)

　　V1---测定时取用体积(ml)

　　D-----稀释倍数

　　W-----样品重量(g)

　　10-----样品重量单位g换算成ug的倍数

　　注意事项:

　　1.一定要注意温度要控制在100℃

　　2.从100℃开始准确计时10min,然后迅速冷却，于室温中平衡10min.

　　3.蒽酮要注意避光保存。配置好的蒽酮试剂也应注意避光，当天配制好的当天使用。

　　4.试管要保证干燥清洁，无残留水滴。