巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对(而非一对)PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。

第二对引物称为巢式引物(因为他们在第一次PCR扩增片段的内部)结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。

• 中文名 巢式PCR
• 外文名 nested PCR
• 反应类型 聚合酶链反应(PCR)
• 反应步骤 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤

工作原理

　　DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

　　但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。 发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

反应步骤

　　PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤

　　①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

　　②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

　　③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP​为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR应用

　　一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等

　　在RACE(rapid-amplification of cDNA ends)中，也利用巢式PCR增加特异性

　　在Illumina公司平台的第二代高通量测序中，也应用类似巢式PCR的原理，进行目的片段的扩增。

　　如图，首先在目的片段通过TA克隆，引入一个片段，然后在特定的一个Flow Cell固定大量的特异探针，通过PCR反应的特异性，扩增目的片段，然后继续应用于下一步测序

　　巢式PCR，可以在10的六次方基因组背景下检测到一个拷贝的病毒基因，也不像二次PCR容易产生成片的产物，是效果最好的PCR，扩增质量最高的PCR。

PCR反应

　　巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片断。第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片断。 第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。从而提高反应的特异性。

实验步骤

　　第一步：目标的DNA模板蓝色的第一对引物结合。第一对引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片断（图中未显示可能的多种产物）。

　　第二步：使用图中红色标记的第二套引物对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。

　　由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片断。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。