基因工程的基本操作程序指的是生物基因工程技术中的一种操作的程序。

• 中文名称 基因工程的基本操作程序
• 外文名称 Basic operating procedures of genetic engineering
• 目标的获取 从基因文库，PCR扩增，人工合成
• 载体构建 目的基因启动子终止子和标记基因
• 目标导入 目的基因进入受体细胞内

目标获取

从基因文库中获取

　　①基因文库:将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。

　　②基因文库的种类:1、基因组文库;2、部分基因文库。

利用PCR技术扩增目的基因

　　①PCR含义:是一项在生物体外复制特定DNA片段的核糖合成技术。全称是多聚酶链式反应。

　　②PCR原理:DNA双链复制。

　　③前提条件:有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。

　　④扩增过程:目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，在DNA聚合酶的作用下进行延伸，如此重复循环多次。

　　⑤结果:每次循环后的目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增。

人工合成

　　如果基因较小，核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。

技术比较

载体构建

组成

　　1、目的基因;2、启动子;3、终止子;4、标记基因。

功能

　　1、使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代;2、使目的基因能够表达和发挥作用。

步骤

　　⑴、用一定的限制酶切割质粒，使之出现一个黏性末端切口。

　　⑵、用同种限制酶切割目的基因，产生相同的黏性末端。

　　⑶、将目的基因片段插入质粒切口，加入适量DNA连接酶，使目的基因与质粒形成重组质粒。

　　⑷、基因表达载体的构成:目的基因+启动子+终止子+标记基因

目标导入

转化

　　目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

受体种类

　　⑴、微生物:细菌细胞

　　⑵、植物细胞:卵细胞、受精卵、体细胞

　　⑶、动物细胞:受精卵、胚胎细胞

导入方法

　　⑴、微生物:感受态细胞法

　　①、感受态细胞:指细菌细胞经过Ca2+处理后，细胞壁透性增强，能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态。

　　②、过程:CaCl2+处理细胞 → 感受态细胞 → 表达载体与感受态细胞混合 → 感受态细胞吸收DNA分子。

　　⑵、植物细胞:农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法

　　①、农杆菌:土壤微生物，易感染双子叶植物和裸子植物;对大多数单子叶植物没有感染力。

　　②、Ti质粒的T_DNA可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体DNA上。

　　③、过程:目的基因插入T_DNA，T_DNA进入农杆菌，将农杆菌导入植物细胞。

　　⑶、动物细胞:显微注射法

　　①、目的基因表达载体经过提纯备用，取得受体动物的卵(或受精卵)备用。

　　②、采用显微注射技术将目的基因表达载体注射到卵(或受精卵)中。

　　③、培养液培养成为早期胚胎。

　　④、将早期胚胎移植到雌性动物子宫内，发育成新个体。

检测鉴定

　　⑴、检测:

　　①、导入检测:检测受体细胞染色体DNA上是否含有目的基因。

　　DNA分子杂交法(DNA探针法)。

　　②、表达检测:检测目的基因是否完成转录出mRNA。

　　分子杂交法检测RNA。

　　检测目的基因是否完成表达翻译成蛋白质。

　　提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。

　　⑵、鉴定:个体生物学水平鉴定，鉴定抗性等。

　　参考:

　　基因工程的基本操作程序