免疫组化技术(Immunohistochemistry)又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体(或抗原)对组织内抗原(或抗体)的分布进行组织和细胞原位检测技术。

• 中文名称 免疫组化技术
• 外文名称 Immunohistochemistry
• 别名 免疫细胞化学

前言介绍

发展介绍

　　--1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体-检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。

　　-- 60年代 Nakane建立酶标抗体技术--铁蛋白标记Ab技术。

　　-- 70年代 Stemberger 改良上述技术，建立辣根过氧化物酶--抗体过氧化物酶(PAP)技术，使免疫细 胞化学得到广泛应用。

　　-- 80年代 Hsu 等建立了抗生物素-生素(ABC)法之后，免疫金-银染色法、半抗原标记法、免疫电镜 技术相继问世。

　　-- 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。

　　--2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的 一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。

技术分类

　　(1)根据染色方式分成:① 贴片染色

　　② 漂浮染色

　　(2)根据Ag-Ab结合方式分成:

　　① 直接法

　　② 间接法

　　③ 多层法

　　(3)按标记物的性质分成:

　　① 免疫荧光技术(免疫荧光法)

　　② 免疫酶技术(酶标抗体法、桥法、PAD 法、 ABC法)

　　③ 免疫金属技术(免疫铁蛋白法、免疫金 染色法、蛋白A金法)

标记物

　　(1)必要性:组织细胞内Ag-Ab结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。

　　(2)常用标记物

　　① 荧光素:最常用的是异硫一氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate ，FITC) -- 荧光显微镜下 呈绿色荧光

　　四乙基罗达明(rho-damine RB200)--荧光显微镜下发橙红色荧光

　　② 酶:辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。

　　③ 生物素:(Biotin)

　　④ 铁蛋白金等:主要应用于免疫电镜。其他:如同位素(因涉及污染和防护难一般不用)

应用

　　凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来。用免疫组织化学方法对所研究的大分子分子进行定位，进而深入研究其功能。

免疫组织化学

　　染色方法

　　1.直接法

　　荧光素直接标记特异性抗体(-抗)上，标记抗体与抗原结合(在切片上)荧光显微镜下观察→检测抗 原。

　　△ 酶标抗体要显示后镜检。

　　直接法优点:简单，时间短，特异性强。 缺点:灵敏度低，所需抗体量大(不经济)。 应用:基本不用!

　　2.间接法 荧光素标记在二抗上(二抗:抗产生一抗动物的 IgG抗体)。

　　※显色后镜检

　　特点:较直接法灵敏，可标记一种抗体→ 鉴定多种抗原。

　　3.非标记Ab桥法:

　　"桥法"是酶标记抗体的改进，经过三次抗体，其二抗为未标记桥抗体。

　　(1)单桥法

　　(2)双桥法

　　在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次，

　　可增大染色强度。

　　★ 特别提示:注意动物种属关系

　　4.PAP法(过氧化物酶-抗过氧化物酶法 Peroxidase anti-peroxidase method， PAP法)

　　~ 是桥法的改良，既先形成PAP复合物→抗原-抗体-抗IgG抗体-PAP复合物。

　　该法简化了操作步骤，提高了灵敏度，所染标本可长期保存。

　　5.ABC法(亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法，Avidin-biotin-peroxidase Complex method，ABC 法)

　　Avidin: 亲和素，一种糖蛋白，其上有4个与生物素相结合的位点。

　　Biotin : 生物素-维生素H，两者亲和力巨大，牢不可破。

　　ABC法与PAP法的区别是:以ABC复合物代替PAP复合物。

　　(1)ABC复合物的制备:

　　(2)ABC法反应原理

　　6.SP或SAP法(过氧化物酶标记的链霉卵 白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染 色) Streptavidin/peroxidase or strepta- vidin/alkaline phosphatase)

　　※ 该法是ABC法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉(而非生物素)结合，而后再结合PO 。

　　它有4个亚基可与生物素结合，灵敏特异， 背景低，成本低。

　　现在还有plus盒。优点是:更简便，放大倍数↑，等电点中性更适合组织。分子量小，穿透力↑。

　　7.蛋白A-金法(Protein-A gold method)

　　~多用于电镜

　　8.双重组化染色法

　　应用双重免疫组织化学激素可在同一张切片，同一细胞或亚细胞结构内同时显示两种不同的抗原。

　　9.免疫金-银染色法

　　(Immunogold-silver staining IGSS)

　　固定--见前述

　　注意事项:

　　1.固定剂的选择:因组织而不同，注意质量和

　　性能。

　　2.固定方式的选择:① 浸渍固定(参考文献)

　　② 灌注固定(+后固定)

　　③ 蒸汽固定

　　免疫组化染色步骤(以ABC法为例)

　　1.切片脱蜡入水，入PBS 洗三次/15分钟。

　　2.封闭内源性过氧化物酶。用新配置的0.3%H2O2 (在PAS或0.05Tris-HCL缓冲液PH7.6中或甲醇中)室 温，30 分钟。

　　3.水洗，入PBS，洗三次，每次5分钟。

　　4.减少非特异性着色用稀释20倍的正常血清(产生二次抗体动物血清!)，室温，30分钟。

　　5.滴加第一抗体，4℃过液或室温5′~1 hour。

　　6.0.1MPBS，洗三次，每次5分钟。

　　7.滴加第二抗体，室温15′~ 60′。

　　8.0.1MPBS 洗净，洗三次，每次5分钟。

　　9.滴加ABC复合物，室温15~60分钟。

　　10.0.1MPBS 洗三次，每次5分钟。

　　11.0.05M Tris –HCL 5~10分钟，此步可省略。

　　12.DAB-H2O2 显色:用0.01%H2O2的DAB溶液，室温5~30分钟，随时镜检(DAB用时新配)

　　13.自来水洗净。

　　14.用Mayer 苏木素或0.5%甲基绿，复染胞核(可不染)。

　　15.常规脱水、透明、封固、镜检。

　　结果:棕褐色反应产物代表抗原X的定位。

　　免疫组化染色基本技术及注意事项

　　1.实验计划

　　① 根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。如Ab-I鼠抗人的抗体，与其他种属间无 交叉，则不能用其他 动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。

　　② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否则无可比性。

　　③ 选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。

　　2.Ab稀释度 (如系购买的药盒有工作液和原液)

　　(1)工作液:无须稀释

　　(2)原液:

　　① 应参照其提供的工作液浓度进行预试验验。

　　如:工作液浓度为1∶1000， 可选1∶500，1∶1000，1∶1500试验;

　　若: 1∶500有背景，1∶1000阳性反应稍浅，可选1∶750进行试验。

　　② 原液的保存(-20℃)冻存--应选最佳稀度冻存。

　　③ 若工作浓度大于1∶500则要先将原液稀释十倍，而后分装10μl/瓶→冻存(-20 ℃)于 冰箱备用。

　　④ 关于Ab保存应参照说明书。

　　(3)Ab浓度的选择

　　Ab浓度不可太高或太低，因为Ag-Ab结合需在一定浓度范围内进行，若一方过剩则形成复合物小且少;极 过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。--并非Ab浓度越高越好。

　　3.Ab滴片技术

　　-- 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。

　　[注意] 滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。

　　要领:甩净组织周围的水。

　　4.PBS洗涤技术

　　(1)洗涤的目的

　　① 保证离子浓度和PH值。

　　② 减少非特异反应(平时Ab不可靠很纯)

　　(2)方法:洗三次，每次5分钟。

　　5.Ab孵育技术

　　(1)必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。

　　(2)温度与时间 4℃:过夜;

　　37℃:2 h or 参考说明书

　　6.光镜控制显色方法

　　(1)室内操作:注意温度与时间的关系，室温最宜5分钟。

　　(2)染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可加深。

　　对照组和染色结果的评价

　　从以下几 个方面综合评价:

　　1.阳性染色特点

　　① Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构性。(非特异性~细胞与组织无区别)

　　② 染色强度不同:颜色深浅不一(非特异性染色 弥散性均匀)

　　2.组织切片制作过程的影响

　　① 固定不良-非特异性染色，显示不均。

　　② 边缘干燥-非特异性染色(常见)，加抗体时勿干片。

　　3.人工假象与特异性结果显示不在同一平面上。

　　阳性对照:

　　用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色。对照切片呈阳性结果，标为阳性对照。

　　阴性对照:

　　用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照。其实这只是阴性对照中的一种，阴性对照 还应包括空白、替代、吸收和抑制实验。

　　▲ 染色失败的几种原因:

　　(1)所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性 对照在内。全部(-)原因可能:

　　① 染色未完全严格按照操作步骤进行;

　　② 漏加一种抗体，或抗体失效;

　　③ 缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性;

　　④ 底物中所加H2O2 量少或失效;

　　⑤ 复染或脱水剂使用不当

　　(2)所有切片均呈阳性反应，原因可能是:

　　① 切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了。

　　② 缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不准确，洗涤不彻底。

　　③ 使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长。

　　④ 抗体温育的时间过长。

　　⑤ H2O2 浓度过高，呈色速度过快。粘附剂太厚。

　　(3)所有切片背景过深，原因可能是:

　　① 未加酶消化处理切片。

　　② 切片或涂片过厚。

　　③ 漂洗不够。

　　④ 底物呈色反应过久。

　　⑤ 蛋白质封闭不够或所用血清溶血。

　　⑥ 使用全血清抗体稀释不够。

　　(4)阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。

　　最常见的原因是:标本的固定和处理不当。