照明在光学显微镜中一直起着十分重要作用。在一个多世纪前提出的柯勒照明，一直是光学显微镜的主要照明技术。近几十年来，发展出许多新的照明技术，意在提高显微镜的某些成像能力。然而，它们中的大多数不适合在宽场条件下观察，因此在显微镜使用广泛的领域，如细胞生物学和微尺度轮廓测量中受到了限制。2005年由Mats Gustafsson开发并提出的结构光照明显微方法，为宽场显微镜技术实现了解析度性能上的突破。此外，它也与现有显微镜兼容。该方法通过在样本本身或其图像上叠加明确定义的图案来修饰照明光，对所得图像套用计算技术以去除结构光照明的影响，并获得预期的高质量图像。这种方法在过去十多年间迅速发展，已经成为细胞生物学和工程学中对微观物体进行光学切片、超解析度成像、表面分析和定量相位成像的关键照明技术。

结构光照明是一种通过改变照明光空间结构的照明方式，通常照明的结构光是一个载频条纹，该照明方式可套用于角度、长度、振动等的测量，并广泛套用于三维成像。这种特别的照明方式通过形成摩尔纹（Moire fringes）来使得在常规照明方式下无法分辨的一些高解析度信息得以变得可见。

摩尔纹产生原理

实际实验过程中在照明光路中插入一个空间光调製器（如光栅，或者数字微镜阵列DMD等），照明光受光栅的调製后经物镜投影在样品上，这样在样品的焦平面收到调製光的照射，在远离焦平面也不受影响，最终调製光所产生的萤光信息通过成像系统被CCD接收，之后通过傅立叶变换将空间域和频域进行变化，从而获得图像。

普通光学显微镜的成像过程可以通过点扩展函式进行描述，通过对点扩展函式进行傅立叶变换，可获得显微系统的光学传递函式。由于衍射极限的存在，光学传递函式限制了通过显微系统的信息量，只允许低频信息通过系统，滤除代表细节的高频信息，即限制了系统的解析度。

2D-SIM突破衍射极限原理

结构光照明显微镜实现超分辨的原理，就是利用特定结构的照明光 在成像过程把位于光学传递函式範围外的一部分信息转移到範围内，利用特定算法将範围内的高频信息移动到原始位置，从而扩展通过显微系统的样品频域信息，使得重构图像的解析度超越衍射极限的限制。

对于光学显微镜系统，光学传递函式的三维结构是圆环结构，在零频位置存在凹陷。凹陷带来的后果就是CCD 上记录的信息不仅包含物镜焦平面上的样品信息，同时包含焦平面外的样品信息。由于受到焦平面外的信息的干扰，常规萤光显微镜无法获得层析图像。三维结构光照明显微镜提高解析度、获得层析图像的原理，就是利用特定结构的照明光来获得样品的高频信息，採用特定算法在横向和纵向上扩展样品频域信息的同时弥补凹陷带来的影响。

3D-SIM成像原理

线性结构光照明显微镜解析度的提高取决于结构照明光空间频率的大小，由于结构照明光也是通过光学系统照射到样品表面的，它同样受到衍射极限的限制，所以解析度无法突破2 倍衍射极限(不考虑照明光和萤光发射波长的不同)。为突破这个限制，萤光分子的非线性效应被引入结构光照明显微镜。

Gustafsson提出了一种基于萤光分子激发态饱和效应的非线性结构光照明显微镜。萤光分子中处于激发态的电子具有萤光寿命，即单个萤光寿命内一个萤光分子只能发射一个光子。当激发光的能量超过一个阈值(单个萤光寿命单个吸收界面内激发光子大于1)的时候，发射光将与照明光不再保持线性关係。这种非线性关係就相当于在照明光中引入多项空间频率数倍于原始照明光频率的谐波成分，在频域空间这些谐波成分就相当于位于不同频率位置的多个δ 函式。δ 函式使更多频率更高的高频信息被移到FOT的圆内，採用与二维结构光照明显微镜相同的算法，可以将获得的高频信息分离并移动到对应位置上扩展频域信息，通过改变照明条纹的方向，可以使频域信息在各个方向上得到均匀扩展。理论上，非线性效应引入的谐波成分是无限的，但是由于受到噪声的影响，只有有限项的谐波能够被用于提取高频信息。

非线性SIM突破衍射极限原理

通过改变宽场萤光显微镜照明光的结构就可以得到结构光照明萤光显微镜，因此，结构光的发生装置是这类显微镜的关键，其余成像部分跟普通的萤光显微镜类似。根据结构光发生装置的区别，SIM可分为以下三种类型：

这类结构光照明萤光显微镜利用光栅来产生余弦结构照明光。光源发的光被耦合进多模光纤，出射光被透镜準直成平行光，经过线偏振片照射光栅，发生衍射，在光路中加入掩膜，只允许±1 级的衍射光通过并聚焦在物镜的后焦面上，经过物镜重新变为平行光，两束光在样品表面发生干涉，产生余弦结构光照明样品，样品发出的萤光经过分色镜在CCD 上成像。这种方法适用于二维结构光照明萤光显微镜。

光栅型SIM

对于光栅型结构光照明萤光显微镜,通过设计光栅的光栅常数、占空比、调製深度等结构参数，增强±1级衍射光的强度，从而提高获取的高频信息的强度，简化装置光路。但是，採用机械的方式来控制光栅旋转和位移的装置複杂，转换速度较低；不同激发波长对应的±1 级衍射角是不一样的，波长改变时需要微调光路，这为多色萤光激髮带来不便。

为了避免用机械控制来改变结构条纹的相位和方向，可使用空间光调製器来产生结构光。光纤出来的光準直之后经过偏振分束器(PBS)、半波片(HWP)射入空间光调製器发生衍射，衍射光经过一个由两片铁电液晶相位延迟器(FLC)和一片四分之一波片(QWP)组成的偏振旋转装置，光路中的掩膜只允许±1 级衍射光进入后续光路并聚焦于物镜的后焦面，经过物镜重新变为平行光，两束光在样品表面发生干涉，产生余弦结构光照明样品，样品发出的萤光经过分色镜在CCD 上成像。

空间光调製器型SIM

利用空间光调製器可以使结构条纹产生和控制的速度和精度得到提高，可以用于活体细胞成像。空间光调製器只能对偏振光进行调製的特点，使得光路略显複杂；激发光偏离空间光调製器工作波长越大，衍射效率越低，因此空间光调製器对应特定的单个激发波长。

这类结构光照明萤光显微镜利用DMD（ 数字微镜晶片）产生用于照明的结构条纹。该结构光照明萤光显微镜整体光路简单，在DMD 之后加入一个镜筒透镜将DMD 上的预设条纹成像于样品表面，完成结构光的照明。DMD 由一系列微反射镜组成(13 μm ×13 μm )，通过改变微镜的偏转角度实现微镜的开关。微镜的开关状态可以通过计算机控制实现，精度高，且开关状态可以进行高速切换。

DMD型

利用DMD 搭建的结构光照明萤光显微镜光路可以快速产生结构条纹，并进行精确控制，可实现生物样品的实时动态成像。DMD 利用反射原理产生结构光，它对宽光谱的入射光都具有较高的反射率，可以实现多波长激发。

基于受激发射损耗萤光显微术(stimulated emission depletion，STED)和基于单分子开关的超高解析度定位技术(包括光激活定位显微成像术 (photoactivated localization microscopy，PALM)和随机光学重建显微法(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM))的超高解析度成像可以得到更高的解析度，但它们的缺点也很明显： 需要很强的激发光来照明样品。通常地球上的生物体受到的太阳的辐射在0.1 W/cm，而STED和PALM/STORM通常所需要的辐射在10~10W/cm，相当于一千个到一亿个太阳的照射。在这种情况下，萤光蛋白/分子很快就被漂白，产生大量的自由基损伤细胞样品。因此，本质上 STED 和 PALM/STORM 类型的超高解析度成像不适合活细胞长时间成像，而比较适合于死细胞和固定样本的成像。相对应的，SIM 成像的方法非常有效地利用萤光分子所发出的光子，有可能成为活细胞超高解析度成像的利器。

Eric Betzig 教授的团队和中国科学院生物物理研究所、美国国立科学研究院 和哈佛医学院等的科学家们合作探索, 发展了新型 的SIM成像技术，使活细胞超高解析度成像成为现实。

SIM的主要套用领域涉及光学切片、超解析度成像、表面轮廓成像，以及相位成像四个方面。

由于生物样品通常较厚，使用普通的光学显微手段难以获得其清晰的全貌，因此发展出了使用光学切片成像重构三维样品全貌的技术手段。SIM採用的光学和计算技术的组合方法，可实现具有如宽视场成像以及更低的光毒性等优点的光学切片。

光学切片

通过三维结构光照明方法可以获得样品在不同切层上的层析图像，从而重构出3D图像。

利用SIM，科学家可以观察到常规萤光显微镜无法分辨的细节信息。通过使用3D-SIM观察细胞，可以获得细胞器结构等亚细胞结构的超解析度图像。

超解析度成像

为了进一步提高解析度，可使用非线性SIM。已有报导将只需要较低能量就能产生非线性效应的可逆光开关萤光蛋白运用于非线性结构光照明萤光显微镜，并用它观察哺乳动物的核膜孔和肌动蛋白细胞骨架，解析度达到60 nm。

在表面成像领域里，经常使用的扫描隧道显微镜（STM）、原子力显微镜（AFM）、扫描电子显微镜（SEM）等非光学显微技术虽然具有更高的解析度，但其成像速度通常较慢。

表面轮廓成像

利用3D-SIM，通常採用正弦条纹结构光照射样品后，通过投影採集、边缘分析、相位展开与校準等步骤，亦可获得较高解析度的表面图像。

使用SIM採集相位物体的图像之后，通过相位重构以及相位扩展，亦可获得具有较高解析度的相点阵图像。

相位成像