2005年，周秀娜以模特的身份参加动漫节，获得亚军。2006年，出演喜剧片《打雀英雄传》；6月，出演喜剧片《新扎师妹3》；同年，出演情景喜剧《老冯日记》。2008年，出演警匪动作片《花花型警》；11月，出演由叶念琛执导的爱情喜剧片《绝代双娇》。

2009年6月，出演由阮世生执导的喜剧电影《矮仔多情》，在片中饰演投资基金天王蓝子杰的未婚妻珠珠；10月，出演喜剧电影《死神傻了》；11月，出演惊悚电影《关人7事》，在片中饰演便利店的女店员秀娜。

2010年3月，与吕慧仪、黎诺懿等合作主演惊悚电影《恶胎》，在片中饰演心术不正的女护士郭少芳；7月，与钟欣潼、黄圣依等合作出演运动喜剧电影《出水芙蓉》，在片中饰演魔鬼队成员马阅；8月，与郭富城、张静初、吴京等合作出演变异人动作电影《全城戒备》，在片中饰演为了赢得上位与出名的目的女主播优优；10月，与杨千嬅、林峰等合作出演喜剧电影《完美嫁衣》，在片中饰演Perfect Wedding的婚礼统筹师Flora；11月，与蒋璐霞、元华等合作主演恐怖电影《殭尸新战士》，在片中饰演与人类友好相处的殭尸一族阿斯。

2011年3月，与曾志伟、杜汶泽合作主演喜剧片《猛男滚死队》；7月，与傅颖、罗仲谦等合作主演爱情电影《热浪球爱战》，在片中饰演从小生活在贝浪湾的Sharon；9月，与杨爱瑾、沈志明等合作出演爱情电影《喜爱夜蒲》；10月，出演由王晶、叶念琛执导的恐怖电影《猛鬼爱情故事》；12月，与罗仲谦、沈志明等合作主演爱情电影《婚前试爱》，在片中饰演结婚前夕因意外目睹男友泽与好友在夜总会出来，而产生误会的打工女郎琪。

2012年1月，与萧敬腾、曾志伟、赵正平等合作主演爱情动作喜剧电影《杀手欧阳盆栽》，在片中饰演有着冷静头脑与理智的电脑高手娜娜；2月，与范逸臣、邓家佳等合作主演惊悚电影《夜店诡谈》，在片中饰演一对性感妖娆的姊妹花艾米与艾丽；7月，主演由林小鑫执导爱情电影《猎音师》，在片中饰演性感、妖娆，亦正亦邪的吸血鬼小叶；8月，与杨幂、刘恺威等合作出演爱情悬疑电影《Hold住爱》，在片中饰演陶小磊的前女友方檬。

2013年1月，与林家栋、曾国珲等合作主演爱情电影《纸月亮》；1月21日，与方力申、李曼等联袂主演的古装悬疑剧《唐朝浪漫英雄》播出，在剧中饰演波斯商人的女儿陶夭夭，这也是周秀娜首次出演内地电视剧；2月，与蓝正龙、谢君豪合作主演惊悚电影《电梯惊魂》，在片中饰演与院长儿子林飞相恋的医院护士白洁；2月10日，出演由周星驰执导的古装神话电影《西游·降魔篇》上映，在片中饰演教段小姐跳舞色诱玄奘的四煞；2月12日，与甄子丹、柯震东等合作出演的爱情电影《在一起》上映；2月24日，与郑嘉颖、韩雪等合作主演的年代剧《叶问》播出，在剧中饰演大杂院包租婆的女儿珍妮；2月25日，与AEG新亚洲娱乐签约；8月，与方力申、张馨予等合作主演爱情冒险电影《致命闪玩》，在片中饰演阿德的前女友Mina；9月，与杜汶泽、邹凯光等合作主演喜剧电影《烂滚夫斗烂滚妻》；9月22日，一直关注慈善事业的周秀娜，在电影《我想结婚的时候你在哪》的开机新闻发布会上，获颁“最美心灵艺术家奖”；10月，与李灿森、孙祖杨等合作主演惊悚电影《冷瞳》，在片中饰演内敛、端庄的富豪千金苏雨辰；12月，与袁咏仪、邱心志等合作主演爱情片《有招没招之爱情达人》；12月10日，主演由向灼执导的推理网剧《Xgirl》播出，在剧中饰演“人体测谎机”孙小美；12月13日，与汪东城、陈汉典等合作主演的时尚喜剧电影《我的美丽王国》上映，在片中饰演天资聪颖、内心纯真的模特周若童。

2014年3月，主演由钱升玮执导的东方爱情魔幻电影《非狐外传》，在片中饰演容貌出众，身份成谜的仙儿；6月，与郑伊健、王菀之合作主演爱情电影《不再说分手》，在片中饰演阿森的“永远对小姐”小岚；8月，主演由车逕行执导的现代都市情感电影《我想结婚的时候你在哪》，在片中饰演婚纱设计师苏菲。

2015年2月，与古天乐、张翰等合作出演侦探喜剧电影《神探驾到》；9月，与郑中基、雨侨合作出演喜剧电影《猛龙特囧》；12月，与陈乔恩、孙艺洲等合作主演爱情电影《台北时间》，在片中饰演每天周旋在各种浮华诱惑之中的王小莫女友。

2016年1月，与吴镇宇、江疏影等合作出演喜剧片《恶人报喜》；1月6日，与辰亦儒、沈建宏等合作主演现代都市灵异类网路剧《美女公寓》播出，在剧中饰演流淌着妖怪血液的长腿辣妹沈亚桐；2月，与卢颂之、童冰玉等合作主演动作片《霹雳囧花》，在片中饰演性格强势，事业心重的女拳手阿宝；7月，与郑伊健、文凯玲等合作主演爱情网路电影《我的极品女神》，在片中饰演拥有玫瑰一样艳丽外貌的机器人iGirl001，她则凭藉该片获得首届亚洲新媒体电影节最佳女演员奖。

2017年，与邓丽欣、乐基儿合作主演爱情电影《女士复仇》，在片中饰演生活温馨甜蜜的女飞贼Dior；2月，与胡定欣、刘心悠等合作主演古装宫廷剧《宫心计2深宫计》；5月，与金燕玲、郑欣宜等合演主演爱情电影《29+1》，在片中饰演保持身材，严格自律的自危派林若君。

2018年1月4日，周秀娜凭藉电影《29+1》，获得第六届高登电影奖华语电影最佳女主角；2月，凭藉电影《29+1》，获得第37届香港电影金像奖最佳女主角的提名；9月，受邀出席第六届十大华语电影表彰典礼，获得年度女演员奖；11月，出演动作悬疑电影《反贪风暴4》；12月，与张晋、戴夫·巴蒂斯塔等合作主演动作电影《叶问外传：张天志》。

2019年4月，与黄宗泽、吴卓羲、关智斌等合作主演警匪剧《战毒》。

2013年，周秀娜与男友陈伟成Avis分手，结束6年的感情。

在周秀娜的身上找到了创作“林若君”这个角色初期的感觉，尤其是看到片场周秀娜专注的表演，完全把控住了这个角色的心里，让观众跟随着她的节奏一步步的体验到了影片想表达的喜怒哀乐。（导演彭秀慧评）

周秀娜性格爽朗，带点男孩子气。但她对爱情、婚姻观却很传统。（新快报评）周秀娜在电影《热浪球爱战》中，身着比基尼尽展飒爽英姿和性感魅力，而片中许多高难度的动作让她有更多机会展示其傲人的事业线与黄金比例的身材。（腾讯网评）

周秀娜凭藉出色的演技与清纯甜美的外形赢得了观众的喜爱，而在电影《喜爱夜蒲》与《杀手欧阳盆栽》中也体现出了花瓶之外的成熟演技。周秀娜凭藉其32、24、35的性感身材，被誉为性感女神“狄娜的接班人”。（网易娱乐评）